แอนติเจน, แอนติบอดีย์ และ คอมพลีเมนต์

แอนติเจน (antigen, Ag) เป็นสารที่ไม่มีในร่างกาย และสามารถกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองแบบจำเพาะขึ้นในร่างกาย ทำให้เกิดแอนติบอดีย์ และ T killer cell ที่จำเพาะต่อแอนติเจนแอนติเจนจะสามารถทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีย์ และ T killer cell ที่เกิดขึ้นนั้นได้สารที่เป็นแอนติเจนได้แก่ โปรตีน (protein),คาร์โบฮัยเดรท(carbohydrate) และ สารประกอบไขมัน เช่น nucleoprotein, lipoprotein, lipopolysaccharide เป็นต้น แต่สารไขมัน (lipid) ไม่เป็นแอนติเจน สารที่เป็นแอนติเจนที่ดีมักจะมีน้ำหนักโมเลกุล 10,000 ขึ้นไป

บนโมเลกุลของแอนติเจนมีส่วนที่เรียกว่า antigenic determinant อยู่ซึ่งจะมีมาก หรือน้อยในโมเลกุลหนึ่ง ๆ ขึ้นอยู่กับขนาดของโมเลกุล และจะเหมือนกันหรือแตกต่างกันเพียงใดขึ้นอยู่กับชนิดของสารนั้น antigenic determinant เป็นส่วนที่กระตุ้น B lymphocyte และ/หรือ T lymphocyte และเข้าทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีย์ หรือ T killer cell

มีสารบางอย่างที่ไม่สามารถชักนำให้เกิดการตอบสนองแบบจำเพาะแต่สามารถทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีย์ หรือ T-killer cell ที่จำเพาะต่อมันได้ เรียกว่า hapten หรือ incompleteantigen อย่างไรก็ตามถ้าให้โมเลกุลของ hapten จับกับสารโมเลกุลใหญ่ ๆ เช่น โปรทีนเสียก่อนจะสามารถชักนำให้มีการตอบสนองแบบจำเพาะได้ สารที่ใช้จับกับ hapten เพื่อให้สามารถกระตุ้นระบบอิมมูนได้เรียกว่า carrier


แอนติบอดีย์ (antibody, Ab) เป็นสารน้ำที่สร้างโดย plasma cell เป็นส่วนใหญ่มีความจำเพาะกับแอนติเจนที่เข้ามากระตุ้นระบบอิมมูนนั้น เมื่อทำปฏิกิริยากับแอนติเจนนั้น ๆ ในร่างกายจะทำให้แอนติเจนหมดฤทธิ์ หรือก่อให้เกิดการทำลายของแอนติเจนนั้น แอนติบอดีย์ส่วนใหญ่จะเกิดหลังจากที่ร่างกายได้รับแอนติเจน ยกเว้น IgG ในทารกแรกเกิดที่มีอยู่ในกระแสโลหิตโดยที่ร่างกายยังไม่เคยได้รับแอนติเจน โดยเป็น IgG ของมารดาที่ผ่านรกมาและยังผลให้ทารกแรกเกิดมีภูมิต้านทานต่อโรคติดเชื้อ (infectious disease) หลาย ๆ โรค

แอนติบอดีย์ เป็นสารโปรตีนพวกแกมม่าโกลบุลิน (gamma globulin) จึงอาจเรียกว่า อิมมูนโนโกลบุลิน (immunoglobulin, Ig) โครงสร้างขั้นพื้นฐานของโมเลกุลอิมมูนโนโกลบุลิน ประกอบด้วย polypeptide chain 4 สาย, 2 สายกลางซึ่งยาวกว่าเรียกว่า heavy (H) chain 2 สายริมซึ่งสั้นกว่าเรียกว่า light (L) chain (ดังรูปที่ 1) H-chain 2 สายใน โมเลกุลเดียวกัน จะเหมือนกันทุกประการ L-chain ก็เช่นเดียวกัน



H chain ของอิมมูนโนโกลบุลินในมนุษย์อาศัยความแตกต่างของลำดับดังกล่าวจึงแบ่งอิมมูนโนโกลบุลินออกได้เป็น 5 class คือ IgG, IgA, IgM, IgD และ IgE อิมมูนโนโกลบุลินแต่ละ class มีความแตกต่างหลายประการ ดังตาราง

ชนิดของ heavy chainIg GIg AIg MIg DIg E
น้ำหนักของโมเลกุล150,000150,000 - 600,0001,000,000201,000190,000
J chain-++--
Secretory component-++--
เปอร์เซนต์ในซีรั่มคนปกติ76168น้อยมากน้อยมาก
สัดส่วนในน้ำคัดหลั่ง+++++++
ความสามารถในการผ่านรกมาสู่บุตรในครรภ์?????
ความสามารถในการทำให้มีการหลั่ง ของ histamine ออกจาก mast cell?????
ความสามารถในการกระตุ้นคอมพลีเมนต์
- โดยทางตรง
- โดยทางลัด

+(IgG1,IgG2,IgG3*)
+ (IgG4)
-
+
+
+++
+
+
-
-
-
-
+
+
ความสามารถในการทำให้แบคทีเรียกรัมลบสลายตัว+++++ ??

แม้ว่าอิมมูโนโกลบุลินจะมีคุณสมบัติเป็นแอนติบอดีย์ แต่เนื่องจากเป็นสารที่มีโมเลกุลใหญ่ ซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลอย่างต่ำที่สุดถึง 150,000 จึงเป็นแอนติเจนที่ดี และเมื่อให้เข้าไปในร่างกายของสัตว์อื่น จะสามารถชักนำให้สัตว์สร้างแอนติบอดีย์ต่อมันได้ แม้มนุษย์ด้วยกัน ถ้ามีความแตกต่างกันที่ยีน (gene) ที่กำหนดการสร้างอิมมูโนโกลบุลิน ก็จะมีโมเลกุลโกลบุลินต่างกันและประพฤติตนเป็นแอนติเจนเมื่อเข้าสู่ร่างกายของอีกคนหนึ่งได้

J chain พบในโมเลกุลของ IgM และในบางโมเลกุลของ IgA เชื่อกันว่ามีหน้าที่เชื่อมโยงโมเลกุลเดี่ยว ๆ ของ IgM หรือของ IgA เข้าด้วยกัน IgM 1 โมเลกุลประกอบด้วย 5 โมเลกุลย่อย ๆ(ซึ่งประกอบด้วย polypeptide chain 4 สาย ดังได้กล่าวมาแล้ว) ดังรูปที่ 2 และ IgA บางโมเลกุลจะประกอบด้วยโมเลกุลย่อย ๆ

Secretory component พบในโมเลกุลของ IgA ที่อยู่ในน้ำคัดหลั่งต่าง ๆ เช่น น้ำลาย,น้ำมูก, น้ำตา, เหงื่อ, น้ำคัดหลั่งในลำไส้, น้ำนมมารดา,และน้ำนมมารดาที่ออกมาในวันแรก ๆ หลังคลอดบุตรที่เรียกว่า colostrum เรียก IgA ในน้ำคัดหลั่งว่า secretory IgA ระยะหลัง ๆ นี้ได้พบว่านอกจาก secretory IgA แล้วยังมี secretory IgA อยู่ในน้ำคัดหลั่งของลำไส้ด้วย เชื่อกันว่า secretory component คงจะมีหน้าที่ป้องกันมิให้โมเลกุลอิมมูโนโกลบุลินถูกน้ำย่อยในทางเดินอาหารทำลาย secretory component มิได้สร้างจาก plasma cell แต่สร้างจากเซลล์เยื่อเมือก (mucosa cell) ที่บุอวัยวะต่าง ๆ ดูโครงสร้างของ secretory IgA

ความสำคัญของ secretory Ig คือ ช่วยป้องกันมิให้จุลชีพหรือแอนติเจนอื่น ๆ ที่จำเพาะกับมันเข้าสู่ร่างกายทางเยื่อเมือกที่บุอวัยวะต่าง ๆ พบว่าคนที่ขาด secretory IgA ในลำไส้มีอุบัติการของโรคติดเชื้อในระบบทางเดินอาหารสูงกว่าคนทั่ว ๆ ไป เนื่องจากจุลชีพสามารถเข้าสู่เซลล์เยื่อบุลำไส้ได้สะดวก และผู้ที่ขาด sIgA ยังมีอุบัติการของการเป็นโรคมะเร็งและโรคออโตอิมมูน (Autoimmune disease) ได้สูง เนื่องจากเชื้อไวรัสเข้าสู่ร่างกายได้ง่าย

คอมพลีเมนต์ (complement,C) เป็นสารโปรตีนพวกโกลบุลิน องค์ประกอบของคอมพลีเมนต์ มี 11 อย่างคือ Clq, Clr, Cls, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 คอมพลีเมนต์อยู่ในซีรั่มคนปกติทั่ว ๆ ไป ตั้งแต่แรกเกิดแล้ว ความสำคัญของคอมพลีเมนต์ในร่างกายเกิดภายหลังจากที่ "ถูกกระตุ้นแล้ว" ผลของการกระตุ้นที่เกิดขึ้นอาจมีประโยชน์ต่อร่างกายเพราะทำให้เซลล์แบคทีเรียหรือไวรัสแตกสลาย (lysis) หรือทำให้จุลชีพต่าง ๆ ถูกจับกินโดยฟาโกซัยท์ได้ง่ายขึ้น หรืออาจจะให้โทษแก่ร่างกายโดยทำให้เกิดการอักเสบ (inflammation) ขึ้นที่อวัยวะต่าง ๆ ตรงที่มีการกระตุ้นคอมพลีเมนต์ เช่น เส้นเลือด, ไต, ข้อ ฯลฯ ดังที่พบในโรค serum sickness, โรคออโตอิมมูนบางอย่าง และอาจทำให้เกิดการทำลายของเม็ดเลือดของร่างกาย เช่น เม็ดเลือดแดง, เกร็ดเลือด ฯลฯ การกระตุ้นของคอมพลีเมนต์เกิดได้ 2 ทาง คือ

  1. ทางตรง (classical pathway) สิ่งที่สามารถกระตุ้นทางนี้ได้คือสารประกอบเชิงซ้อนของแอนติเจนกับแอนติบอดีย์ (Ag-Ab complex) และโมเลกุลอิมมูโนโกลบุลินที่จับกันเป็นก้อน (aggregated immunoglobulin) โดยที่อิมมูโนโกลบุลินในทั้ง 2 กรณีเป็น IgM หรือ IgG (subclass IgG1, IgG2 และ IgG3) องค์ประกอบของคอมพลีเมนต์อันแรกที่ถูกกระตุ้นคือ C1 จากนั้นจะมีการกระตุ้นกันต่อ ๆ ไป เป็นลูกโซ่เรียงตามลำดับดังนี้ คือ C 1,4,2,3,5,6,7,8,9,
  2. ทางลัด (alternate pathway) สิ่งที่กระตุ้นทางนี้ได้แก่สาร polysaccharide ซึ่งมีอยู่ที่ผนังของแบคทีเรียกรัมลบ, สาร polysaccharide ที่ผนังของแบคทีเรียกรัมบวก และแคปซูล (capsule) ของแบคทีเรียบางชนิด, สาร zymosan ที่ผนังของเชื้อรา, aggregated IgG4, aggregated IgA, aggregated IgE และพิษงูเห่า จากการที่ส่วนประกอบของจุลชีพบางชนิดสามารถกระตุ้นคอมพลีเมนต์ได้นี้เอง ยังผลให้ร่างกายต่อสู้กับจุลชีพได้ก่อนที่จะมีการตอบสนองแบบจำเพาะ (specific immune response) เกิดขึ้น (ดังที่ได้กล่าวไว้แล้วในตอนภูมิคุ้มกันแบบไม่จำเพาะ) ในการกระตุ้นทางลัดนี้ องค์ประกอบแรกที่ถูกกระตุ้นคือ C3 และจะเกิดการกระตุ้นต่อไปตามลำดับ เช่นเดียวกับการกระตุ้นโดยตรง คือ C 3,5,6,7,8,และ 9


Aggregated Ig นี้อาจมีปะปนอยู่ในซีรั่มที่ใช้รักษาโรค (therapeutic immune serum) ซึ่งอาจกระตุ้นคอมพลีเมนต์และนำไปสู่โรคภูมิแพ้ที่เรียกว่า serum sickness หรือ anaphylactic shock ได้

เมื่อแอนติเจนและแอนติอบดีย์พบกัน

เมื่อแอนติบอดีย์พบกับแอนติเจนที่จำเพาะของมัน (แอนติเจนชนิดที่เป็นตัวชักนำให้ระบบอิมมูนสร้างมันขึ้น) จะเข้าทำปฏิกิริยากันเกิดเป็นสารประกอบเชิงซ้อนทางอิมมูน (immune complex หรือ Ag-Ab complex) และแล้วจะถูกจำกัดให้หมดไปจากร่างกายต่อไป ทำให้ร่างกายไม่เป็นโรคหรือหายจากโรค แต่ในบางกรณีถ้าสารประกอบเชิงซ้อนนั้นเกิดขึ้นมากหรือคงอยู่ในร่างกายนาน อาจจะกลับให้มีการทำลายอวัยวะของร่างกายเองหรือที่เรียกว่า ภาวะภูมิแพ้ (hypersensitivity,allergy) ซึ่งทำให้เกิด "โรค" ปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดีย์ที่จำเพาะต่อกันนี้ถ้าเกิดขึ้นนอกร่างกาย เช่น ในหลอดทดลอง การเปลี่ยนแปลงอาจปรากฎให้เห็นด้วยตาเปล่า ซึ่งถ้าเราได้นำมาใช้ให้เป็นประโยชน์ในการตรวจซีรั่มเพื่อหาแอนติบอดีย์ที่จำเป็นต่อแอนติเจนซึ่งรู้ชนิดแล้ว หรือในทางกลับกันให้ตรวจหาแอนติเจน ที่จำเพาะต่อแอนติบอดีย์ซึ่งรู้ชนิดแล้ว


การทำปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดีย์ แบ่งเป็น

  1. การตกตะกอน (precipitation) เกิดเมื่อแอนติเจนเป็นสารละลาย (soluble Ag)
    ในร่างกาย (in vivo) ปฏิกิริยาเกิดขึ้นเมื่อมีการติดเชื้อแบคทีเรียที่สร้างท๊อกซิน(toxin) หรือติดเชื้อไวรัสซึ่งเป็นจุลชีพที่มีขนาดเล็กมาก ทำให้ท๊อกซินหรือไวรัสหมดฤทธิ์ในการทำให้เกิดโรคแล้วสารประกอบอิมมูนเชิงซ้อนจะถูกกำจัดโดย phagocytosis ต่อไป
    นอกร่างกาย (in vitro) ถ้าอัตราส่วนระหว่างแอนติเจน และแอนติบอดีย์พอเหมาะกันเมื่อทำปฏิกิริยากันแล้ว จะเกิดตะกอนขุ่นขาวให้เห็น ทั้งที่ก่อนหน้านั้นเป็นสารใสทั้ง 2 อย่าง
  2. การจับกลุ่ม (agglutination) เกิดเมื่อแอนติเจนอยู่บนผิวเซลล์ (cellular antigen)
    ในร่างกาย - เกิดขึ้นเมื่อได้รับเม็ดเลือดแดงที่ต่างหมู่กับที่ตนมีอยู่ หรือเมื่อติดเชื้อแบคทีเรียแล้ว cell-Ab complex ก็จะถูกจับกินโดยฟาโกซัยท์ต่อไป
    นอกร่างกาย - ตามปกติแล้วสารน้ำที่มีเม็ดเลือดแดง หรือแบคทีเรียอยู่จะมองเห็นขุ่น เมื่อใส่แอนติบอดีย์ที่จำเพาะลงไป เซลล์ดังกล่าวจะจับกลุ่มเป็นก้อนใหญ่ ๆ มองเห็นชัดเจน
  3. การกระตุ้นคอมพลีเมนต์ (complement activation หรือ complement fixation)
    สารประกอบเชิงซ้อนอิมมูนที่เกิดขึ้นจากแอนติเจนทั้งที่เป็นสารละลายและเซลล์จะสามารถกระตุ้นคอมพลีเมนต์ได้ทั้งสิ้น และก่อให้เกิดผลต่าง ๆ ตามมา
    ในร่างกาย - ผลที่เกิดขึ้นจากการกระตุ้นคอมพลีเมนต์คือ phagocytosis และ lysis ดังที่ได้กล่าวไว้แล้วในตอน "คอมพลีเมนต์"
    นอกร่างกาย - สารน้ำสีแดงขุ่นซึ่งมีเม็ดเลือดแดงอยู่ เมื่อใส่แอนติเจนที่จำเพาะต่อเม็ดเลือดแดงและคอมพลีเมนต์ลงไป จะทำให้เม็ดเลือดแดงแตก และสารน้ำสีแดงขุ่นกลายเป็นสีแดงใสให้เห็นได้

ปฏิกิริยาแอนติเจน-แอนติบอดีย์ชนิดต่าง ๆ

1. ปฏิกิริยาการจับกลุ่ม (agglutination)

เป็นปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนที่เป็นเซลล์เช่นเซลล์เม็ดเลือดแดง, เซลล์แบคทีเรีย หรือพวกเม็ดสารที่เคลือบด้วยแอนติเจนที่ละลายได้ อันได้แก่พวกเม็ดลาเทก (Latex) กับแอนติซีรั่มหรือแอนติบอดีย์ที่เหมาะสม และเกิดการจับกลุ่มกันของเม็ดหรือเซลล์ที่เป็นแอนติเจน

ปฏิกิริยาการจับกลุ่มถูกนำมาใช้ประโยชน์ในการตรวจสอบเชื้อโรคต่าง ๆ ว่าเป็นเชื้อชนิดใด หรือใช้ในการตรวจหาแอนติบอดีย์ต่อแอนติเจนที่คาดหวัง เช่น ตรวจหาแอนติบอดีย์ต่อเชื้อ Salmonella เพื่อช่วยในการวินิจฉัยโรคไทฟอยด์ ใช้ในการทดสอบก่อนการใช้โลหิตกับผู้ป่วย ว่าโลหิตของผู้ให้กับโลหิตของผู้รับเข้ากันได้หรือไม่

กลไกการเกิดปฏิกิริยาจับกลุ่ม คือการที่แอนติบอดีย์ใช้ antigen binding site ข้างหนึ่งจับกับแอนติเจนตัวหนึ่งและ binding site อีกข้างหนึ่งจับกับแอนติเจนอีกตัวหนึ่งทำให้เกิดการสานกันขึ้นเป็นร่างแห ซึ่งทำให้เห็นว่ามีการรวมกลุ่มกันเกิดขึ้น ดังนั้นปฏิกิริยาการจับกลุ่มจะเกิดขึ้นได้ เมื่อแอนติเจนจะต้องมี antigenic determinant มากกว่า 1

อนึ่ง ถ้าแอนติเจนเป็นพวกแบคทีเรียหรือเม็ดเลือดแดง ปฏิกิริยาการจับกลุ่มจะเกิดขึ้นได้ยากเพราะเซลล์พวกนี้ที่ผิวเซลล์จะมีประจุเป็นลบและมีแรงผลักต่อกัน ทำให้แอนติบอดีย์จะจับเซลล์เหล่านี้เข้าด้วยกันเป็นไปได้ยาก ดังนั้นถ้าตัวกลางในการเกิดปฏิกิริยามีพวกเกลือที่เป็นกลางร่วมอยู่ด้วย เช่นเกลือโซเดียมคลอไรด์ในปริมาณที่เหมาะสม (0.15 M NaCl) จะทำให้ปฏิกิริยาเกิดได้ดีขึ้น และการเอียงสไลด์ไปมาก็เป็นการทำให้แอนติเจนทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีย์ และสานต่อกันได้เร็วยิ่งขึ้นด้วย

ปฏิกิริยาจับกลุ่มเชิงปริมาณ

ปฏิกิริยานี้สามารถนำไปใช้หาปริมาณอย่างคร่าว ๆ ของแอนติบอดีย์ที่มีต่อแอนติเจนได้ โดยการแปลผลเป็นไตเตอร์ (titer) ซึ่งสามารถกระทำได้โดยเจือจางซีรั่มที่นำมาตรวจสอบเป็น Serialdilution โดยเจือจางลงทีละ 2 เท่า หรือ 5 เท่า แล้วแต่ความละเอียดที่ต้องการ เมื่อเจือจางแล้วทุกหลอดจะมีปริมาตรของหลอดเท่า ๆ กัน (แต่จะมีปริมาณแอนติบอดีย์ไม่เท่ากัน) จากนั้นเติมแอนติเจนลงไปในจำนวนที่เหมาะสมและเท่ากันทุกหลอด ผสมให้เข้ากันและนำไปอบที่ 37oC 30 นาทีจากนั้นปั่นเบา ๆ และนำมาอ่านผลโดยดูการจับกลุ่มกันของแอนติเจน ปฏิกิริยานี้ในระยะหลังนิยมทำแบบ Microtiter system เพราะประหยัดสารต่าง ๆ ได้มาก การอ่านผลโดยดูการเกาะกลุ่มกัน และแปลผลเป็นไตเตอร์ คือส่วนกลับของ dilution ที่สูงที่สุดที่ยังเกิดการเกาะกลุ่มกันเองแอนติเจน โรคที่ใช้ปฏิกิริยานี้ไปช่วยในการวินิจฉัยคือ โรคไทฟอยด์, โรค rickettsial disease เป็นต้น



Prozone ในการใช้ปฏิกิริยาการจับกลุ่มในการตรวจหาปริมาณแอนติบอดีย์ที่กล่าวมาแล้วนั้นปรากฎว่าในบางครั้งหลอดต้นๆ ที่ความเข้มข้นของแอนติบอดีย์สูงจะไม่เกิดปฏิกิริยา แต่เกิดปฏิกิริยาในหลอดถัด ๆ ไป ทั้งๆ ที่ปริมาณแอนติบอดีย์น้อยกว่า ปรากฎการณ์นี้เรียกว่า Prozone ซึ่งอธิบายได้คือการที่มีแอนติบอดีย์ในปริมาณสูง จะไม่เกิดการสานต่อ ๆ กันของแอนติเจน แต่จะมีการจับระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดีย์


แสดงให้เห็น Prozone ในคนไข้รายที่ 6

ปฏิกิริยา Passive agglutination ปฏิกิริยานี้เป็นปฏิกิริยาการจับกลุ่มอีกแบบหนึ่ง แต่มีข้อแตกต่างจากปฏิกิริยาการจับกลุ่มโดยทั่วไปคือ แอนติเจนที่ทำปฏิกิริยานั้นเป็นแอนติเจนที่ละลายได้ และถูกนำไปเคลือบติดกับสารที่เป็นเม็ด เช่น เม็ดลาเทกซ์ หรือเซลล์ เช่น เม็ดเลือดแดง แล้วจึงนำมาทำปฏิกิริยาอีกขั้นหนึ่ง ถ้ามีแอนติบอดีย์ที่เหมาะสมทำปฏิกิริยาด้วย จะเกิดปฏิกิริยาการจับกลุ่มเกิดขึ้นยกตัวอย่างเช่น ใช้นำมาหาแอนติบอดีย์ต่อสารพิษของเชื้อโรคที่ทำให้เกิดโรคคอตีบ หรือหาแอนติบอดีย์ต่อ thyroglobulin

ปฏิกิริยา Passive agglutination inhibition ปฏิกิริยานี้เป็นการประยุกต์ออกไปจากปฏิกิริยา Passive agglutination สามารถนำไปหาปริมาณแอนติเจนได้ค่อนข้างละเอียด โดยการนำเอาแอนติเจนที่ละลายได้ไปเคลือบบน inert particle จากนั้น ขั้นตอนการตรวจสอบทำได้โดยนำเอาสิ่งที่จะหาปริมาณแอนติเจน มาเจือจางแบบ serial dilution และเติมแอนติบอดีย์ที่มีปริมาณที่เหมาะสม (ได้จากการ titration) กับแอนติเจนที่เคลือบอยู่บน inert particle) สมมุติว่าสิ่งที่นำมาตรวจสอบมีแอนติเจนอยู่มากพอที่จะจับกับแอนติบอดีย์ที่เติมลงไปจนหมด ดังนั้นถ้าเติมแอนติเจนที่เคลือบอยู่บน inert particle ลงไปอีกครั้งหนึ่ง จะไม่มีการเกิด agglutination แต่ถ้าในตัวอย่างที่นำมาตรวจสอบไม่มีแอนติเจน แอนติบอดีย์ที่เติมลงไปยังมีอยู่ ดังนั้นจึงสามารถทำปฏิกิริยากับแอนติเจนที่เคลือบอยู่บน inert particle เกิด agglutination ได้ ตัวอย่างการนำปฏิกิริยานี้ไปใช้คือ การตรวจหาปริมาณ human chorionic gonadotropin (HCG) เพื่อช่วยในการตรวจสอบภาวะตั้งครรภ์หรือการตรวจหา Fibrin degradation product เป็นต้น หลักการทดลองมีดังนี้


ปฏิกิริยา reverse passive agglutination เป็นปฏิกิริยาอีกปฏิกิริยาหนึ่งที่ประยุกต์ออกไปจาก passive agglutination คือการนำเอาแอนติบอดีย์ที่ทราบว่าต่อแอนติเจนที่ตรวจสอบ ไปเคลือบบนเม็ดลาเท็กซ์หรือเม็ดเลือดแดงเพื่อนำไปใช้ตรวจหาแอนติเจน เช่นการตรวจหาเชื้อไวรัสที่ทำให้เกิดโรคตับอักเสบ เป็นต้น


2. ปฏิกิริยาตกตะกอน (Precipitation)

ปฏิกิริยาตกตะกอนเป็นการทำปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนที่ละลายได้กับแอนติบอดีย์จำเพาะเจาะจงต่อกัน สิ่งที่เกิดขึ้นเป็นตะกอนของแอนติเจน-แอนติบอดีย์ การเกิดตะกอนนี้ ขึ้นอยู่กับอัตราส่วนของแอนติเจนและแอนติบอดีย์ที่ทำปฏิกิริยากันต้องมีความเหมาะสม และแอนติเจนต้องมี antigenic determinant มากกว่าหนึ่ง

กลไกในการเกิดปฏิกิริยาตกตะกอน ปฏิกิริยานี้แบ่งออกเป็น 2 ขั้นตอน ขั้นตอนแรกจะมีการจับกันอย่างรวดเร็วได้ แอนติเจน-แอนติบอดีย์ ที่ยังสามารถละลายได้ ขั้นตอนนี้ใช้เวลาน้อยมาก ประมาณ 1-2 นาที ขั้นตอนที่สองจะมีการสานกันไปมาระหว่างแอนติเจน-แอนติบอดีย์-แอนติเจน....จนเกิดเป็นตะกอนให้เห็นซึ่งใช้เวลานานเป็นชั่วโมงขึ้นไป นอกจากนี้ยังพบว่าตะกอนที่เกิดขึ้นมีคุณสมบัติเป็น hydrophobic ดังนั้นถ้าในตัวกลางที่มีเกลือที่เป็นกลางละลายอยู่ด้วย จะทำให้เกิดการตกตะกอนได้ดีขึ้น เพราะเกลือจะเป็นตัวแย่งน้ำ

ปฏิกิริยาตกตะกอนสามารถแบ่งออกตามตัวกลางที่เกิดปฏิกิริยาได้เป็น 2 ชนิดคือ 1) เกิดขึ้นในตัวกลางที่เป็นของเหลว และ 2) เกิดปฏิกิริยาในตัวกลางที่เป็นวุ้น

  1. ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นในของเหลว
    ปฏิกิริยาที่ตกตะกอนในของเหลวนี้ ไม่ค่อยถูกนำมาใช้ในการช่วยวินิจฉัยโรคมากนัก แต่มีประโยชน์มากในการศึกษากลไกการเกิดปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดีย์ ซึ่งเป็นพื้นฐานของปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดีย์ทั่ว ๆ ไป เช่น ศึกษา antigenic determinant ของแอนติเจนปริมาณแอนติบอดีย์ การเกิด cross reaction เป็นต้น
  2. ปฏิกิริยาตกตะกอนในตัวกลางที่เป็นวุ้น

ปฏิกิริยานี้ถูกนำมาใช้ในการวินิจฉัยโรคอยู่หลายโรค ปฏิกิริยานี้มีหลักพื้นฐานเหมือนกับปฏิกิริยาตกตะกอนในของเหลว เพียงแต่ว่าตะกอนที่เกิดขึ้นนั้น จะแทรกตัวอยู่ในวุ้น ทำให้เห็นเป็นเส้นหรือแนวของตะกอนได้ มีประโยชน์ในการศึกษาวิเคราะห์แอนติเจนและแอนติบอดีย์ได้ นอกเหนือไปจากการตรวจว่ามีหรือไม่แล้ว ปฏิกิริยานี้แบ่งออกได้เป็นหลายชนิด ตามการแพร่กระจาย และทิศทางของการแพร่กระจาย คือ

  1. Single diffusion in one dimension แพร่กระจายตัวเดียว อาจจะเป็นแอนติเจนหรือแอนติบอดีย์ก็ได้ ในทิศทางเดียวกัน
  2. Double diffusion in one dimension ทั้งแอนติเจนและแอนติบอดีย์แพร่กระจายทั้งคู่ในทิศทางเดียว
  3. Single diffusion in two dimensions แพร่กระจายตัวเดียวอาจจะเป็นแอนติเจนหรือแอนติบอดีย์ก็ได้ แต่โดยทั่วไปมักจะเป็นแอนติเจน มีชื่อเรียกปฏิกิริยานี้อีกคือ Radial immuno diffusion หรือ Mancini's technique
  4. Double diffusion in two dimensions แพร่กระจายทั้งสองตัว คือทั้งแอนติเจนและแอนติบอดีย์ และเป็นการแพร่กระจาย 2 มิติ มีชื่อเรียกว่า Ouchterlony technique

Single diffusion in one dimension วิธีนี้ Oudin เป็นผู้รายงาน โดยการผสมแอนติซีรั่มกับวุ้นเหลว เทลงในหลอดทดลอง เมื่อวุ้นแข็งตัวดีก็จะเติมแอนติเจนที่เป็นของเหลว บริเวณที่ผิวรอยต่อกันระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดีย์จะมีความเข้มข้นของแอนติเจนสูงมาก เมื่อเวลาผ่านไปแอนติเจนจะแพร่กระจายลงสู่ส่วนของวุ้นที่มีแอนติซีรั่มอยู่ เมื่อปริมาณของแอนติเจน และแอนติบอดีย์อยู่ในอัตราส่วนที่เหมาะสม ก็จะเกิดเป็นเส้นตะกอนให้เห็นอยู่ในชั้นของวุ้นที่มีแอนติซีรั่มอยู่แอนติเจนจะแพร่กระจายลงมาอยู่เรื่อย ๆ สิ่งที่เกิดขึ้นคือบริเวณที่เคยมีปริมาณแอนติเจนที่เหมาะสมต่อการเกิดเส้นตะกอนได้เปลี่ยนแปลงไป คือจะกลายเป็นบริเวณที่มีแอนติเจนมากเกินไปนั้นเอง ดังนั้นตะกอนที่เคยเห็น จะกลายไปเป็น soluble immune complexes และบริเวณที่มีปริมาณแอนติเจนที่เหมาะสมจะอยู่ถัดลงไปอีก ดังนั้นจึงเห็นว่าเส้นตะกอนเลื่อนลงไปข้างล่างเมื่อเวลาผ่านไป เส้นตะกอนจะเคลื่อนลงสู่หลอดทดลองด้วยความเร็วมากน้อยขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของแอนติเจน รูปร่างและขนาดของแอนติเจน ถ้าแอนติเจนมีความเข้มข้นสูง ตัวเล็ก รูปร่างไม่เทอะทะ การเคลื่อนที่ของเส้นตะกอนลงสู่ก้นหลอดจะเป็นไปด้วยอัตราเร็วในทางตรงข้าม ถ้าแอนติเจนมีความเข้มข้นน้อย น้ำหนักโมเลกุลมาก รูปร่างเทอะทะ การแพร่กระจายจะเกิดด้วยอัตราที่ช้า

อนึ่ง วิธีนี้มีข้อสังเกตุคือ ถ้ามีแอนติเจนอยู่หลายตัว และมีแอนติบอดีที่อยู่ในแอนติซีรั่มเหมาะสมกับแอนติเจนเหล่านั้น ความเข้มข้น รูปร่างของแอนติเจนเหล่านั้นอยู่ในเงื่อนไขที่ทำให้การแพร่กระจายเป็นไปด้วยอัตราที่ไม่เท่ากันแล้ว สิ่งที่เกิดขึ้นคือ จะเห็นเส้นตะกอนหลายเส้น แต่อาจจะมีบางเส้นทับกันได้ ถ้าภาวะการเกิดเส้นตะกอนของแอนติเจน-แอนติบอดีย์นั้นใกล้เคียงกันมาก ดังนั้นการเกิดเส้นตะกอนที่มองเห็นด้วยตาเปล่า 1 เส้น หมายถึง มีแอนติเจน-แอนติบอดีย์ทำปฏิกิริยากันอย่างน้อย 1 คู่


Double diffusion in one dimension วิธีนี้เป็นการประยุกต์ต่อมาจากปฏิกิริยา Single diffusion in one dimension มีกระบวนการทำดังนี้คือ นำเอาแอนติซีรั่มผสมกับวุ้นเหลว (ในอุณหภูมิที่วุ้นยังเป็นของเหลว 50 oC) เทลงในหลอดทดลอง และเมื่อวุ้นที่มีแอนติซีรั่มผสมอยู่แข็งตัวดีแล้วก็เติมวุ้นธรรมดาที่ปราศจากทั้งแอนติเจนและแอนติบอดีย์ เติมลงไปอีกชั้นหนึ่งเมื่อวุ้นชั้นนี้แข็งตัวดีแล้ว จึงเติมแอนติเจนซึ่งจะผสมกับวุ้นหรือไม่ก็ได้เป็นขั้นบนสุด ดังนั้นแอนติเจน และแอนติบอดีย์จะแพร่กระจายเข้าหากันในชั้นของวุ้นซึ่งปราศจากทั้งแอนติเจนและแอนติบอดีย์ เมื่อแอนติเจนและแอนติบอดีย์มาพบกันในอัตราส่วนที่เหมาะต่อการเกิดตะกอน ก็จะสามารถเห็นเส้นตะกอนเกิดขึ้นได้ชัดเจนเมื่อเวลาผ่านไปก็จะมีแอนติเจน และแอนติบอดีย์แพร่กระจายเข้าสู่บริเวณนี้ทั้งคู่ จึงทำให้เส้นตะกอนไม่เคลื่อนที่ไปจากตำแหน่งเดิม วิธีนี้ใช้วิเคราะห์ของแอนติเจนและแอนติบอดีย์ว่ามีอยู่กี่คู่ที่ทำปฏิกิริยากันเช่น ถ้านำเอาซีรั่มที่ได้จากคนที่ฉีดด้วย diphtheria toxoid มาทำกับ diphtheria toxin จะสามารถเห็นเส้นตะกอนที่เกิดขึ้นได้ถึง 6 เส้น


Single diffusion in two dimensions เป็นอีกปฏิกิริยาหนึ่งที่ให้แอนติเจนและแอนติบอดีย์ทำปฏิกิริยากันในวุ้น ตัวแพร่กระจายตัวหนึ่งจะแพร่กระจาย 2 มิติ คือ ในระดับระนาบ โดยการนำแอนติซีรั่มซึ่งส่วนมากจะเป็นแอนติซีรั่มต่อแอนติเจนที่ทราบแน่นอนแล้วผสมกับวุ้น เทลงบนแผ่นสไลด์หลังจากที่วุ้นแข็งตัวดี แล้วก็ทำการเจาะรูขนาดประมาณ 3 มม. (เส้นผ่าศูนย์กลาง) จากนั้นเติมแอนติเจนลงไป เมื่อเวลาผ่านไปแอนติเจนจะแพร่กระจายออกไปรอบๆ หลุมทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีย์ในแอนติซีรั่มที่ผสมอยู่ในวุ้นรอบๆ หลุมบริเวณที่มีปริมาณของแอนติเจนและแอนติบอดีย์เหมาะสมกันดีก็จะเกิดตะกอนขึ้น ซึ่งจะทำให้เกิดเส้นวงเส้นตะกอนรอบหลุมที่เติมแอนติเจน ขนาดของวงเส้นตะกอนจะใหญ่หรือเล็ก จะขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของแอนติเจนที่เติมลงไปในหลุมนั้น ๆ ดังนั้นถ้าทราบความเข้มข้นแน่นอนของแอนติเจนและเติมลงไปในหลุมโดยกำหนดความเข้มข้นที่แตกต่างกันแต่ทราบค่าแน่นอนวงเส้นตะกอนจะมีขนาดเล็กไปหาใหญ่ ซึ่งค่าที่ได้นี้สามารถนำมาสร้างเป็นเส้นกราฟมาตรฐาน เพื่อใช้ในการตรวจสอบหาความเข้มข้นของตัวอย่างที่นำมาตรวจต่อไป


Double diffusion in two dimensions ปฏิกิริยานี้ทั้งแอนติเจนและแอนติบอดีย์จะแพร่กระจายเข้าหากันรอบทิศทาง ในระดับระนาบในตัวกลางที่เป็นวุ้น เพื่ออัตราส่วนอยู่ในความเหมาะสมที่จะเกิดการตกตะกอน จะเกิดเส้นตะกอนเกิดขึ้นในวุ้น เส้นตะกอน 1 เส้น หมายถึงว่ามีแอนติเจนและแอนติบอดีย์ทำปฏิกิริยากันอย่างน้อย 1 คู่ ลักษณะของเส้นตะกอนที่เกิดขึ้นมีประโยชน์มากในการวิเคราะห์แอนติเจนและแอนติบอดีย์แบ่งปฏิกิริยาที่เกิดขึ้น


3. Immunofluorescence

Immunofluorescence เป็นวิธีการที่นำเอาปฏิกิริยาแอนติเจน-แอนติบอดีย์มาใช้ร่วมกับสารประกอบที่สามารถเรืองแสงได้เมื่อถูกกับแสงที่มีพลังงานสูง เช่น แสงอุลตร้าไวโอเลต สามารถนำมาใช้ตรวจหาตำแหน่งของแอนติเจน และแอนติบอดีย์ในเซลล์ หรือเนื้อเยื่อต่าง ๆ ตรวจหาชนิด และปริมาณของแอนติบอดีย์ในตัวอย่างที่มาทดสอบได้


ปฏิกิริยาแอนติเจน-แอนติบอดีย์ ที่ใช้สารเรืองแสงเข้ามาช่วยแสดงปฏิกิริยา ทำได้หลายวิธี

  1. Direct Method ใช้ตรวจหาแอนติเจนโดยใช้แอนติบอดีย์ที่ทราบแน่นอนว่าต่ออะไรและติดกับสารเรืองแสงย้อมลงบนสิ่งต้องการตรวจสอบโดยตรง เช่น ใช้หาว่ามีการเกาะติดอยู่ของโปรตีนพวก Immunoglolobulin, Complement, Fibrin และอื่น ๆ ติดอยู่บนเนื้อเยื่อหรือไม่ และใช้แยกแยะชนิดของเชื้อจุลชีพ


  2. Indirect method วิธีนี้ใช้ตรวจหาแอนติบอดีย์ในซีรั่ม ดังนั้นต้องมีแอนติเจนที่ทราบแน่นอน นำไปตรวจหาแอนติบอดีย์ต่อเขื้อต่าง ๆ เช่น แอนติบอดีย์ต่อเชื้อซิฟิลิส, การตรวจหา Autoantibody ในซีรั่ม

4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

ELISA เป็นวิธีการที่ใช้เอนไซม์นำไปติดกับแอนติบอดีย์ทำให้แอนติบอดีย์นั้นมีทั้ง immunolo-gical activity และมี enzymatic activity ด้วย หลักใหญ่ของการตรวจสอบจึงคล้ายการตรวจสอบโดยวิธี immunofluorescence (IF) และ RIA (Radio-immunoassay) เนื่องจากการตรวจสอบโดยวิธี IF ใช้เวลานานในการทำและการตรวจสอบสไลด์ที่ย้อมแล้ว สำหรับ RIA นั้นเครื่องมือมีราคาแพงมาก และมีความยุ่งยากในการใช้สารรังสี ห้องปฏิบัติการขนาดเล็กไม่สามารถกระทำได้ ดังนั้น จึงได้มีผู้พยายามคิดหาสารตัวอื่นมาติดกับแอนติบอดีย์ เช่น ใช้ bacteriophages, ใช้โลหะ และ free radicals จนมาถึงเอนไซม์ ในระบบของเอนไซม์ที่ย่อย substrate และ ให้ product ที่มีสีหรือเรืองแสงจึงเป็นเสมือนระบบภาคขยายปฏิกิริยาทำให้วิธีนี้มีความไวสูงมาก